低频突变检测

(1) 突变基因偏向扩增技术(LMD-PCR): 将非天然核酸引入到PCR体系中作为封闭序列,在特定变性温度下被封闭的野生型序列仍然保持结合状态,而有单碱基错配的突变型序列已经解链处于单链状态,从而实现对突变型和野生型基因的差异扩增(突变型为指数扩增,野生型则为线性扩增),达到对突变基因的高度富集。该技术不仅检测灵敏度高(结合普通Sanger测序,即可检出样本中低至1%的突变基因),而且可以检出封闭序列覆盖范围内的任意突变,更重要的是可以与包括Sanger测序、HRM、焦磷酸测序等各种下游分析技术之间实现无缝衔接。

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图1. LMD-PCR流程图
 
(2) 基于人工模拟核酸的新型分子信标:分子信标是一种设计巧妙的荧光标记核酸探针,在空间结构上呈发夹型,由环和茎杆组成,环部序列与靶DNA序列互补,长约15-35个核苷酸,茎杆部分长约5-7个核苷酸,由GC含量较高的与靶序列无关的互补序列构成。自由状态时分子信标呈发夹结构,此时标记在两端的荧光基团以及淬灭基团极为接近,荧光几乎被完全淬灭;而当分子信标的环状区与序列完全互补的靶标分子结合形成双链杂交体时,信标茎杆互补区被拉开,此时荧光分子和猝灭分子距离大大增大,荧光得以恢复。理想状态下,相对于传统Taqman探针,分子信标的灵敏度更高,特异性更强。但理想状态下,分子信标只有环状区是与靶序列互补的,杂交时只有探针的环状区与靶序列结合,而茎杆部分不能模板结合,然而茎杆部分的引入常常会导致分子信标与模板序列之间产生一些非特异性相互作用,从而导致背景信号增强,进而影响检测效率。要消除这种背景噪声,就会对分子信标的设计尤其是茎杆区的序列设计产生很高的要求。针对这一不足,福安华创造性的将一种非天然碱基对引入到分子信标的茎杆区,由于这一非天然碱基对不会与任何天然碱基发生配对,因而显著消除了茎杆区序列所带来的各种非特异性相互作用,使得分子信标的设计大大简化。此外,通过向环状区引入与天然核酸具有更强亲和力的人工模拟核酸,我们使得分子信标的环状区的长度变得可控,显著提高了其用于识别单碱基错配等方面的性能。


UBPBMB-1
图2. 分子信标原理和应用图
 
(3)基于人工模拟核酸的突变基因单链分离技术(LMD-SSCT):利用非天然核酸设计钓饵序列,实现低丰度突变基因的单链分离鉴定,发现新型突变位点。经过3轮分离,该技术配合Sanger测序,可检出样本中低至1%的突变基因,而且可以检出钓饵序列覆盖范围里的任意突变。与LMD-PCR相似,该技术同样可以与包括Sanger测序、HRM、焦磷酸测序等各种下游分析技术之间实现无缝衔接。目前,本公司正在开发基于这一技术的探针捕获技术,有望在液体活检领域实现突破。

LMDSSCT
图3. LMD-SSCT原理和应用图

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